Возраст и способность к восстановлению ДНК яйцеклеток
Цель исследования
Выяснить, оказывает ли возраст женщины негативное влияние на способность к репарации ДНК яйцеклеток, оплодотворенных сперматозоидами с контролируемым уровнем повреждения ДНК?
Общее заключение
По сравнению с ооцитами молодых женщин, ооциты более возрастных женщин имеют меньший потенциал репарации повреждений ДНК, внесенных в клетку сперматозоидом.
Что уже известно
Репродуктивный потенциал женщины снижается с возрастом преимущественно из-за изменений, происходящих в яйцеклетках. Это приводит к снижению шансов на беременность у женщин старшей возрастной группы, проходящих лечение с помощью вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), по сравнению с молодыми женщинами. Старение и качество яйцеклеток были четко связаны с анеуплоидией, но спектр факторов, влияющих на это изменение качества яйцеклеток с возрастом, остается неясным. Считается, что активность репарации ДНК момента активации собственного генома эмбриона имеет материнское происхождение, причем материнские транскрипты и белки контролируют целостность ДНК. С увеличением возраста матери количество мРНК в яйцеклетках уменьшается. Это может привести к снижению эффективности репарации ДНК и/или негативному влиянию на развитие эмбриона, особенно при наличии повреждений ДНК.
Дизайн исследования
Яйцеклетки, полученные после стимуляции суперовуляции у самок мышей двух возрастных групп по 30 шт. (молодые: 5-8 недель, n = 15; старые: 42-45 недель, n = 15) были оплодотворены спермой пяти самцов с тремя различными контролируемыми уровнями повреждения ДНК. Контроль: ≤10%, 1 Грей (Gy): 11-30% и 30 Грей: >30%. Оплодотворенные яйцеклетки (молодые: 125, старые: 78) оценивали на предмет образования зигот (на одну яйцеклетку) и бластоцист (на одну зиготу). Пять репликатов пяти зародышевых пузырьков (GVs) и пять ооцитов MII из каждой возрастной группы были проанализированы на экспрессию генов. Реакция повреждения ДНК оценивалась как минимум в трех репликах ЭКО в контроле и зиготах из группы 1Гр и двухклеточных эмбрионах с использованием маркировки yH2AX.
Материалы и методы
Сперматозоиды, полученные из семенных придатков самцов мышей C57BL6, обрабатывались методом swim-up и были разделены на контрольную (без облучения) и 1- и 30-Гр группы. Обработанные сперматозоиды облучали при 1 и 30 Гр соответственно с помощью линейного ускорителя Varian 21iX. После облучения образцы использовали для оценки повреждения ДНК (Halomax) и для оплодотворения. Предполагаемые зиготы культивировались в time-lapse инкубаторе (MIRI, ESCO). Экспрессию генов 91 гена репарации ДНК оценивали с помощью системы Fluidigm Biomark HD. Реакция на повреждения ДНК у зигот (6-8 ч после оплодотворения) и двухклеточных эмбрионов (22-24 ч после оплодотворения) оценивалась иммуноцитохимическим анализом yH2AX с использованием конфокальной микроскопии (Olympus FV1200) и объемного 3D-анализа с использованием программного обеспечения IMARIS.
Результаты
Среднее повреждение ДНК сперматозоидов для трех групп статистически различалось (контроль: 6,1%, 1 Гр: 16,1%, 30 Гр: 53,1%, Р < 0,0001), но не было достоверных различий в показателях оплодотворения после ЭКО внутри или между двумя возрастными группами [(молодые; контроль: 86,79%, 1 Гр: 82,75%, 30 Гр: 76,74%) (старые; контроль: 93,1%, 1 Гр: 70,37%, 30 Гр: 68,18%) точно по Фишеру]. Однако показатели бластоцист были достоверно различны (Р < 0,0001) среди групп [(молодые; контроль: 86,95%, 1 Гр: 33,33%, 30 Гр: 0,0%) (старые; контроль: 70,37%, 1 Гр: 0,0%, 30 Гр: 0,0%)]. Между возрастными группами образцы 1-Гр показали значительное снижение частоты развития до бластоцисты у возрастных самок по сравнению с молодыми (Р = 0,0166). Анализ экспрессии генов выявил снижение относительной экспрессии 21 гена репарации ДНК в ооцитах GV возрастных самок по сравнению с молодыми ооцитами GV (Р < 0,05), и аналогично возрастные ооциты MII показали 23 гена со сниженной экспрессией по сравнению с молодыми ооцитами MII (Р < 0,05). Количество генов со сниженной экспрессией в ооцитах GV и MII более возрастных самок значительно повлияло на такие пути, как репарация двойных разрывов ДНК (GV: 5; MII: 6), репарация выпадения единичных нуклеотидов (GV: 8; MII: 5) и реакция на повреждение ДНК (GV: 4; MII: 8). Наблюдалось снижение реакции на повреждение ДНК в зиготах и двухклеточных эмбрионах у возрастных самок по сравнению с молодыми независимо от обработки спермы (Р < 0,05). Снижение экспрессии генов репарации ДНК в ооцитах и снижение реакции на повреждения ДНК в эмбрионах, полученных от более возрастных самок, свидетельствует о том, что старение приводит к снижению способности репарации ДНК.
Ограничения
Ионизирующее излучение использовалось только в экспериментальных целях – для получения контролируемого уровня повреждения ДНК сперматозоидов; однако оно также может повреждать белки сперматозоидов. Женские возрастные группы, отобранные у мышей, были предназначены для моделирования эффектов у молодых и возрастных женщин, но необходимы клинические исследования для демонстрации аналогичного эффекта.
