Оценка влияния морфологии бластоцисты точность на неинвазивного преимплантационного генетического тестирования (NIPGT-A) с использованием культуральной среды эмбриона в сочетании с жидкостью бластоцеля.
Цель исследования:
Влияет ли морфология бластоцисты на концентрацию внеклеточной ДНК, выделенной из эмбриональных культуральных сред (ECCM) и жидкости бластоцеля (BF), а также на точность неинвазивного преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидии (NIPGT-A) с использованием этой ДНК?
Краткий ответ:
Концентрация внеклеточной ДНК в культуральной среде после культивирования эмбриона (ECCM) и жидкости бластоцеля (BF), а также точность NIPGT-A не зависят от морфологии бластоцисты.
Актуальность исследования:
Сравнительно недавно внеклеточная эмбриональная ДНК (cfeDNA) была найдена как в BF, так и в ECCM. Эти исследования показали, что BF, ECCM или комбинирование ECCM и BF потенциально могут быть использованы для неинвазивной диагностики анеуплоидий и выявления моногенных заболеваний. Однако этот подход должен быть оптимизирован, прежде чем его можно будет широко применять в клинической практике. Важно достигнуть более глубокого понимания природы внеклеточной эмбриональной ДНК, продуцируемой клетками эмбрионов человека в BF и ECCM. Более ранние исследования показали, что концентрация cfeDNA коррелирует с апоптотическими явлениями. Следовательно, бластоцисты более низкого качества могут иметь более высокую скорость апоптоза и, как результат, более интенсивно продуцировать cfeDNA.
Дизайн исследования:
Это проспективное исследование, в котором мы проанализировали количество амплифицированной ДНК и результаты секвенирования нового поколения (NGS) из 71 комбинированного образца ECCM и BF и соответствующих им 71 образца биопсии трофэктодермы (TE), полученных из свежих бластоцист (n=71). Эмбрионы были получены от 21 пациента, проходивших цикл ЭКО+ПГТ-А с октября по декабрь 2018 года в возрасте 29-42 лет (37,0 ± 3,3).
Материалы и методы:
Эмбрионам был проведен вспомогательный хетчинг на 4 день, и они были перенесены в свежие 15 мкл-капли среды Global-HP HSA. Морфологию экспандированных и неэкспандированных бластоцист 5/6-го дня оценивали по упрощенной балльной системе SART: хорошее (≥BB:– AA,AB,BA,BB) (n=35) и умеренное/низкое качество (<BB: - AC, CA,BC,CB,CC) (n=36). Как ECCM, так и BF были собраны как один образец NIPGT после коллапсирования бластоцист с помощью лазера. В качестве контроля использовались соответствующие образцы трофоэктодермы. Продукты амплификации всего генома (WGA) оценивали с помощью набора Qubit3.0-Флуорометра, BioAnalyzerTM и набора VeriSeqTM PGS-NGS.
Основные результаты:
WGA-ДНК была обнаружена во всех образцах NIPGT-A (n=71) и TE (n=71). Среднее количество WGA-ДНК NIPGT-A было ниже для бластоцист хорошего качества по сравнению с умеренным/низким качеством бластоцист 13,9 ± 0,9 нг/мкл (5,1-30,0 нг/мкл) против 15,7 ± 1,0 нг/мкл (6,3-36,0 нг/ мкл) соответственно, однако разница не была статистически достоверной. Средний размер фрагментов WGA-ДНК образцов NIPGT от бластов хорошего качества составил 746,9±42,6 bp и 736,9±26,9 bp – от бластов среднего/низкого качества. Информативные результаты NIPGT-A были получены из 98,6% биопсий TE (70/71) и из 88,7% образцов NIPGT-A (63/71). Конкордантный показатель статуса плоидности (эуплоидный/анеуплоидный) между образцами биопсии NIPGT и TE для бластоцист хорошего (31/31, 100%) и умеренного/низкого (32/32, 100%) качества статистически не отличался. NIPGT-А позволил правильно определить пол эмбрионов и анеуплоидию во всех образцах NIPGT. Учитывая количество ДНК NIPGT-A WGA из разных бластоцист и размер фрагментов ДНК NIPGT-A WGA (не близкий к размеру нуклеосомы), вероятно, что апоптоз клеток не является единственным механизмом высвобождения ДНК в BF и ECCM из внутренней клеточной массы и трофэктодермы. Поэтому логично предположить наличие других механизмов высвобождения эмбриональной ДНК, которые или пассивны, или активны, или функционируют в паре.
Ограничения исследования:
Это исследование было ограничено количеством образцов. Риск возможной контаминации материнской ДНК образцов, полученных неинвазивно, из-за остаточных клеток лучистого венца может быть уменьшен. В этом плане есть возможность для дополнительной оптимизации методов выделения, амплификации и анализа эмбриональной ДНК из образцов NIPGT-A