Как вырастить микроглию из плюрипотентных клеток в монокультуре
28.12.2022
Поделиться
Разработан оптимизированный состав среды, в которой индуцированные плюрипотентные клетки человека дифференцируются в микроглию. Клетки, выращенные таким образом, — перспективная экспериментальная модель. Морфологический и транскриптомный анализ подтверждают их максимальное сходство с клетками, полученными из нервной ткани.
Источник изображения: 123rf.com
Микроглия — это особый подтип глиальных клеток, резидентные макрофаги спинного и головного мозга. Их предшественники заселяют мозг на самых ранних этапах нейрогенеза. Микроглия играет важную роль в формировании синапсов между нервными клетками и поддержании их работы. Нарушение ее функций может приводить к развитию нейрогенеративных заболеваний.
В экспериментах обычно используется микроглия, полученная из ЦНС грызунов, поскольку доступ к микроглии человека ограничен. К тому же микроглия чувствительна к окружению, ее исследование in vitro приводит к иммунной активации; состояние клеток не тождественно их состоянию в организме, что искажает исследование физиологии заболевания. Нужна адекватная модель, которая была бы физиологически и морфологически близка к состоянию клеток in vivo.
Исследователи из Великобритании предложили использовать в качестве такой модели индуцированные плюрипотентные стволовых клеток (иПСК), способные дифференцироваться в первичную микроглию, которая по транскрипционному профилю сходна с микроглией, развивавшейся в организме. Методы получения микроглии из иПСК были разработаны в различных лабораториях, в том числе и авторами исследования. В протоколах использовались различные комбинации факторов роста и добавок к средам, включая IL-34, TGF-β1, M-CSF, GM-CSF, CD200, CX3CR1, добавки B27 и N-2. В новой работе авторы сравнили, как различные комбинации факторов роста, компонентов среды и субстрата влияют на фенотипы иПСК-микроглии, транскриптомы полученных клеток и их выживаемость в монокультуре. Их целью был поиск протокола, который позволит наилучшим образом воспроизвести микроглию человека in vitro, без необходимости совместного культивирования с другими типами клеток или ксенотрансплантации.
Для экспериментов использовали три линии иПСК от здоровых доноров, эксперименты воспроизводили в двух лабораториях. После дифференцировки в микроглию изучали морфологию полученных клеток, а также выделяли РНК и методом количественной ПЦР исследовали экспрессию микроглиальных маркеров. Также проводили секвенирование РНК единичных клеток (scRNA-seq) с использованием технологий 10х Genomics. Данные scRNA-seq сравнили с опубликованными транскриптомными наборами данных для других индуцированных клеток, клеток, полученных ex vivo и первичными типами клеток.
Оказалось, что добавление в среду IL 34 вместе с колониестимулирующими факторами роста M-CSF и GM-CSF способствуют развитию макрофагоподобного фенотипа и лучшей выживаемости клеток. Было выявлена устойчивая активация маркерных генов микроглии CX3CR1, MERTK и OLFML3 в среде, содержащей фактор роста TGF-β1.
Авторы отказались от таких компонентов, как В27, используемый в средах для поддержания роста и плотности нейронов и N-2, который рекомендуется для роста и экспрессии нейробластом. Также исключили FBS (фетальная бычья сыворотка), которая индуцировала экспансию фибробластов в культуре. CD200 и CX3CL1 не оказали влияния на экспрессию генов микроглии.
Таким образом, улучшенная среда, способствующая дифференцировке иПСК (авторы обозначили ее аббревиатурой ITMG), содержала IL-34, TGF-β1, M-CSF и GM-CSF.
СТАТЬЯ: Sam J. Washer et al. Single-cell transcriptomics defines an improved, validated monoculture protocol for differentiation of human iPSC to microglia // Scientific Reports, 12, 19454 (2022), published online 14 November 2022. DOI: 10.1038/s41598-022-23477-2
Источник
Источник изображения: 123rf.com
Микроглия — это особый подтип глиальных клеток, резидентные макрофаги спинного и головного мозга. Их предшественники заселяют мозг на самых ранних этапах нейрогенеза. Микроглия играет важную роль в формировании синапсов между нервными клетками и поддержании их работы. Нарушение ее функций может приводить к развитию нейрогенеративных заболеваний.
В экспериментах обычно используется микроглия, полученная из ЦНС грызунов, поскольку доступ к микроглии человека ограничен. К тому же микроглия чувствительна к окружению, ее исследование in vitro приводит к иммунной активации; состояние клеток не тождественно их состоянию в организме, что искажает исследование физиологии заболевания. Нужна адекватная модель, которая была бы физиологически и морфологически близка к состоянию клеток in vivo.
Исследователи из Великобритании предложили использовать в качестве такой модели индуцированные плюрипотентные стволовых клеток (иПСК), способные дифференцироваться в первичную микроглию, которая по транскрипционному профилю сходна с микроглией, развивавшейся в организме. Методы получения микроглии из иПСК были разработаны в различных лабораториях, в том числе и авторами исследования. В протоколах использовались различные комбинации факторов роста и добавок к средам, включая IL-34, TGF-β1, M-CSF, GM-CSF, CD200, CX3CR1, добавки B27 и N-2. В новой работе авторы сравнили, как различные комбинации факторов роста, компонентов среды и субстрата влияют на фенотипы иПСК-микроглии, транскриптомы полученных клеток и их выживаемость в монокультуре. Их целью был поиск протокола, который позволит наилучшим образом воспроизвести микроглию человека in vitro, без необходимости совместного культивирования с другими типами клеток или ксенотрансплантации.
Для экспериментов использовали три линии иПСК от здоровых доноров, эксперименты воспроизводили в двух лабораториях. После дифференцировки в микроглию изучали морфологию полученных клеток, а также выделяли РНК и методом количественной ПЦР исследовали экспрессию микроглиальных маркеров. Также проводили секвенирование РНК единичных клеток (scRNA-seq) с использованием технологий 10х Genomics. Данные scRNA-seq сравнили с опубликованными транскриптомными наборами данных для других индуцированных клеток, клеток, полученных ex vivo и первичными типами клеток.
Оказалось, что добавление в среду IL 34 вместе с колониестимулирующими факторами роста M-CSF и GM-CSF способствуют развитию макрофагоподобного фенотипа и лучшей выживаемости клеток. Было выявлена устойчивая активация маркерных генов микроглии CX3CR1, MERTK и OLFML3 в среде, содержащей фактор роста TGF-β1.
Авторы отказались от таких компонентов, как В27, используемый в средах для поддержания роста и плотности нейронов и N-2, который рекомендуется для роста и экспрессии нейробластом. Также исключили FBS (фетальная бычья сыворотка), которая индуцировала экспансию фибробластов в культуре. CD200 и CX3CL1 не оказали влияния на экспрессию генов микроглии.
Таким образом, улучшенная среда, способствующая дифференцировке иПСК (авторы обозначили ее аббревиатурой ITMG), содержала IL-34, TGF-β1, M-CSF и GM-CSF.
СТАТЬЯ: Sam J. Washer et al. Single-cell transcriptomics defines an improved, validated monoculture protocol for differentiation of human iPSC to microglia // Scientific Reports, 12, 19454 (2022), published online 14 November 2022. DOI: 10.1038/s41598-022-23477-2
Источник
