Меню каталога
Закрыть


02.10.2019

Создание и проверка пользовательского протокола обнаружения микроРНК в отработанных средах после культивирования бластоцисты: поиск биомаркеров имплантации

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Можно ли достоверно считать микроРНК, обнаруженные в средах после культивирования бластоцист (СПКБ), предполагаемыми биомаркерами имплантационного потенциала эуплоидных эмбрионов?

КРАТКИЙ ОТВЕТ

Корректировка данных в отношении качества бластоцисты и дня, когда она полностью экспандирована, снижает точность прогнозирования на основе быстрого, недорогого, воспроизводимого и удобного пользовательского протокола выявления 10 микроРНК из СПКБ.

ЧТО УЖЕ ИЗВЕСТНО

Эуплоидия до сих пор является самым сильным предиктором качества бластоцисты. Тем не менее, около 50% эуплоидных бластоцист не имплантируются. Некоторые исследования, проведенные на протяжении нескольких лет, показали, что между эмбрионом и эндометрием существует взаимосвязь, направленная на установление беременности. МикроРНК в данном случае рассматриваются в качестве посредников. Были испробованы несколько дорогостоящих, трудоемких и сложных протоколов и получены многообещающие результаты, но убедительные данные крупных клинических исследований отсутствуют.

ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ

Данное исследование проводилось в два этапа с сентября 2015 года по декабрь 2017 года. На этапе 1 профиль микроРНКома бластоцисты человека определяли из внутренней клеточной массы (ICM) и соответствующей ей трофэктодермы (TE) шести донорских бластоцист. С этой целью применялись два различных протокола. Параллельно провели 6 пулов по 10 СПКБ каждый (3 из имплантировавшихся эуплоидных бластоцист, ИЭБ; и 3 из неимлантировавшихся эуплоидных бластоцист, не-ИЭБ). Был разработан быстрый, недорогой и удобный пользовательский протокол для профилирования miRNA из СПКБ. На этапе 2 в трех центрах ЭКО было собрано 239 СПКБ после ИЭБ и не- ИЭБ. Исключив из анализа 18 сред после культивирования некачественных бластоцист, по ранее разработанному пользовательскому протоколу получили и сравнили данные из 107 СПКБ после не-ИЭБ и 114 – после ИЭБ. Данные были скорректированы на основе логистической регрессии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Донорские бластоцисты подвергались отделению ВКМ от ТЭ. СПКБ были собраны во время циклов ЭКО, с применением ICSI, культивированием бластоцисты в одношаговой среде, биопсией TЭ без вспомогательного хетчинга на 3 сутки, количественным ПЦР (qPCR) для выявления анеуплоидий с последующим селективным криопереносом одного эмбриона. Не-ИЭБ и ИЭБ разделили на 2 группы по исходам переносов. Для анализа ВКМ и ТЭ были приняты карты Taqman Low Density Array (TLDA) и протоколы анализа Exiqon microRNA human panel I+II qPCR. Последний использовался также для пулов СПКБ. Затем был разработан кастомизированный протокол и планшет на основе рабочего процесса Exiqon, утвержденный и окончательно адаптированный для анализа СПКБ на 2 этапе исследования. Этот протокол позволяет проводить анализ 10 микроРНК из 10 СПКБ в течение 3 часов с момента сбора образцов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Протокол TLDA cards включал более высокий процент ложноположительных результатов (5,6% против 2,8% с Exiqon). В ВКМ и ТЭ было обнаружено 44 микроРНК в обоих протоколах. Одну и 24 микроРНК обнаружили в ВКМ и ТЭ соответственно. В целом 29 микроРНК были обнаружены в СПКБ: 8 после не-ИЭБ, 8 после ИЭБ и 13 после обоих. Большинство из них (N = 24/29, 82,7%) также были обнаружены ранее как в ВКМ, так и в ТЭ с протоколом Exiqon; две микроРНК (N = 2/29, 6,9%) ранее были обнаружены только в ТЭ, а три (N = 3/29, 10,3%) ранее не были идентифицированы. На 2 этапе исследования были показаны значительные различия между не-ИЭБ и ИЭБ с точки зрения выявления микроРНК и количественной оценки. Однако, когда данные были скорректированы относительно морфологии эмбриона и дня развития до экспандированной бластоцисты (т. е. сбора СПКБ), существенная связь не подтвердилась.

ОГРАНИЧЕНИЯ

Это исследование не оценивало конкретно экзосомальные микроРНК, тем самым снижая вероятность идентификации функциональных микроРНК. Эксперименты ex-vivo необходимы для подтверждения роли микроРНК во взаимодействии с клетками эндометрия. Кроме того, для профилирования определения микроРНК с целью использования в клинической практике должны использоваться более высокопроизводительные технологии.

ВЫВОДЫ

Хотя исследование не показало клинического подтверждения прогностической силы метода, отсутствие необходимости инвазивных исследований, связанных с анализом СПКБ, и доказательства того, что эмбриональный генетический материал из СПКБ может быть обнаружен и проанализирован, делают этот казалось бы ненужный продукт ЭКО важным источником для дальнейших исследований.

Оригинал статьи


Назад к статьям