Поклеточное секвенирование РНК идентифицирует молекулярные мишени , связанные с плохими показателями созревания ооцитов IN VITRO, полученных при стимуляции яичников
Цель исследования
Определить сигнатуру транскриптома, связанную с низкой эффективностью созревания ооцитов при rescue IVM (rIVM), и выяснить как мы можем на это повлиять?
Краткое резюме
Сигнальная ось GATA-1/CREB1/WNT была супрессирована в ооцитах rIVM, особенно низкого качества; восстановление этой оси может привести к получению большего количества пригодных для использования ооцитов в rIVM.
Актуальность
rIVM направлена на получение зрелых ооцитов (MII) для ЭКО через IVM незрелых ооцитов, полученных из стимулированных яичников. Он не пользуется популярностью из-за низкой эффективности в лечении бесплодия. Генетические аберрации, клеточный стресс и отсутствие поддержки кумулюсных клеток в ооцитах могут объяснить неудачи rIVM.
Дизайн исследования
Мы применили секвенирование РНК единичных клеток (scRNA-seq) для определения транскриптомов ооцитов человека in vivo (IVO) (n = 10) от 7 доноров и ооцитов rIVM (n = 10) от 10 доноров. Также было изучено влияние возраста матери и реакции яичников на транскриптомы ооцитов rIVM. Параллельно мы изучали влияние галловой кислоты на скорость созревания ооцитов мышей, культивируемых в среде IVM с (n = 84) и без (n = 85) галловой кислоты.
Материалы и методы
Ооциты человека были получены у доноров в возрасте 28-41 года с индексом массы тела <30. Извлечение РНК, генерация кДНК, построение библиотеки и секвенирование проводились в одном препарате. Затем данные scRNA-seq были обработаны и проанализированы. Выбранные гены в сравнении rIVM и IVO были подтверждены количественной ПЦР в реальном времени. Для исследования галловой кислоты мы собрали незрелые ооциты от 5-месячных мышей и изучили влияние 10-мкМ галловой кислоты на скорость их созревания.
Результаты
Транскриптомные профили ооцитов rIVM/IVO показали различия. Было обнаружено, что в общей сложности 1559 дифференциально экспрессированных генов (DegS, гены с по меньшей мере 2-кратным изменением и скорректированным Р < 0,05) обогащены метаболическими процессами, биосинтезом и окислительным фосфорилированием. Среди этих генов (DEG) мы выявили подавление сигнала WNT/β-катенина в rIVM по сравнению с ооцитами IVO. Мы обнаружили, что уровни эстрадиола демонстрировали значительную независимую от возраста корреляцию с соотношением зрелых ооцитов IVO (MII ratio) для каждого донора. Было обнаружено, что ооциты rIVM у женщин с высоким коэффициентом MII имеют чрезмерно выраженные клеточные процессы, такие как антиапоптоз. Для дальнейшего выявления мишеней, которые способствуют плохим клиническим исходам rIVM, мы сравнили ооциты, собранные от молодых доноров с высоким коэффициентом MII, с ооцитами от доноров более старшего возраста и более низким коэффициентом МII, и выявили, что CREB1 является важным регулятором. Таким образом, наше исследование показало, что сигнализация GATA-1/CREB1/WNT была подавлена как в ооцитах rIVM по сравнению с ооцитами IVO, так и в ооцитах rIVM более низкого и более высокого качества. Следовательно, мы исследовали галловую кислоту как потенциальный антиоксидантный субстрат в среде rIVM человека и обнаружили, что она увеличивает скорость созревания ооцитов мыши на 31,1%.
Исходные данные этого исследования можно получить через GSE158539.
Ограничения
Количество образцов ооцитов rIVM высокого и низкого качества было ограничено после фильтрации данных с использованием строгих критериев отбора. Для идентификации степени цитологической зрелости ооцитов мы не имели возможности определять наличие веретена деления ооцитов, поэтому единственным показателем была экструзия полярного тела.