Аминокислоты и ВРТ
Многие ассоциируют аминокислоты с белком, синтезом ДНК, субстратом для производства энергии. Однако за последние два десятилетия мы выработали совершенно другую оценку аминокислот и их разнообразной роли в регулировании физиологии эмбрионов. Рассмотрим их функции (помимо бодибилдинга!) и то, как увеличились показатели успешности ЭКО во всем мире благодаря добавлению аминокислот в среды для культивирования эмбрионов.
Переломный момент в культивировании эмбрионов
В течение первых двух десятилетий ЭКО аминокислоты, которые обычно есть во всех средах для культивирования клеток и тканей, как ни странно, отсутствовали в средах для культивирования эмбрионов. В значительной степени среды, изначально разработанные для эмбрионов мыши в 1960-х годах, представляли собой сбалансированный солевой раствор с добавлением глюкозы, пирувата и лактата. Эмбрионы мыши и человека росли в таких средах, но с невысокой скоростью. Кроме того, формирование бластоцисты обычно задерживалось на срок до 24 часов, и показатель жизнеспособности после переноса был низким. Переломный момент в культивировании эмбрионов наступил после плодотворной работы Миллера и Шульца в 1987 году 1. Они проанализировали аминокислотный состав фаллопиевых труб и матки кролика и отметили высокое содержание специфических аминокислот, таких как глицин, глутамат, аланин, серин и таурин. Это само по себе стало интересным и значительным наблюдением, поскольку эти аминокислоты не входят в число тех, что требуются соматическим клеткам. Так почему они присутствуют в большой концентрации и что они делают? Вопросы, к которым мы вернемся позже.
Достижение стадии бластоцисты в нужное время
В течение 1990-х годов был всплеск исследований роли аминокислот в развитии эмбрионов кроликов, хомяков, мышей, овец и крупного рогатого скота, и в дальнейшем это принесло много пользы для процесса культивирования (обзор в 2, 3). Что касается наших собственных исследований эмбрионов мыши еще в начале 1990-х годов, эмбрионы культивировали с 1-клеточной стадии в сбалансированных солевых растворах и углеводах. Для достижения стадии бластоцисты понадобилось 5 дней культивирования. Следовательно, зиготы, культивирование которых началось в понедельник, достигали стадии бластоцисты к пятнице. Хотя это удобно вписывалось в рабочую неделю, развитие бластоцисты опаздывало на 24 часа. И действительно, бластоцисты мыши in vivo имплантировались бы вечером в четверг, то есть на четвертый день. В наших первых экспериментах мы стали добавлять в питательные среды аминокислоты, которые в высоких концентрациях присутствуют в фаллопиевых трубах 4. Представьте себе наше удивление, когда в четверг днем мы обнаружили, что каждый отдельный эмбрион, который культивировали с добавлением аминокислот, превратился в полностью экспандированную бластоцисту, в то время как эмбрионы контрольной группы все еще были в стадии морулы. Я до сих пор помню, как у меня волосы встали дыбом, когда я посмотрел в микроскоп (я даже засомневался, не перепутал ли дни, и на самом деле пятница!). Бластоцисты развились вовремя (это был отличный рабочий день!).
Палка о двух концах
Как и во всех хороших научных историях, в нашей очень быстро возникли сложности. Стало очевидно, что в определенных концентрациях аминокислоты, которые приносили наибольшую пользу на стадиях дробления, отличались от тех, что стимулировали формирование бластоцисты. И наоборот: аминокислоты, которые стимулировали рост внутренней клеточной массы, оказывали вредное влияние на стадии дробления. Это может быть связано с различными функциями аминокислот (см. ниже). Со временем полезный эффект добавленных аминокислот уменьшался, но при смене среды улучшение развития эмбрионов продолжалось. Впоследствии было показано, что это происходит из-за накопления аммония в среде, вызванного как спонтанным дезаминированием аминокислот при 37 °С, так и метаболизмом аминокислот эмбрионов 4. Накопление аммония в среде оказалось гораздо более зловещей проблемой, чем мы первоначально предполагали, поскольку его постоянное воздействие на эмбрионы приводило к неблагоприятным исходам после переноса и дефектам нервной трубки плода в ~ 20% случаев 5. Тем не менее, нам удалось исправить ситуацию за счет внесения двух изменений. Во-первых, наиболее лабильную аминокислоту глутамин мы заменили на стабильную дипептидную форму (аланил-глутамин), а во-вторых, производили смену среды каждые 48 часов. C тех пор аммоний не накапливался, а аминокислоты способствовали развитию плода после переноса бластоцисты без каких-либо патологических последствий 5. Действительно, в современных составах сред Vitrolife уровни аммония никогда не достигают токсических значений даже после непрерывного культивирования до стадии бластоцисты.
Предупреждение о накопительном стрессе
В научном мире принято оспаривать новые открытия. Так произошло и в случае с негативным воздействием аммония на развитие плода. В то время как одни группы столкнулись с аналогичными проблемами, другие не смогли их обнаружить 6. Это несоответствие оставалось неразрешенным в течение нескольких лет, пока не выяснили, что использование атмосферного (20%) кислорода для культивирования меняет метаболическую функцию эмбрионов и приводит к невозможности нейтрализовать аммоний 7. Первоначальные исследования, в которых наблюдались дефекты нервной трубки, были выполнены после культивирования эмбрионов в 20% кислороде 4, а более поздние исследования, которые не смогли воспроизвести эти результаты, были выполнены в 5% кислороде 6. Таким образом, история с аммонием подчеркивает сложности культивирования эмбрионов; в этом случае, когда есть угроза двух стрессов, результатом могут стать тяжелые и часто неожиданные неблагоприятные исходы 8, 9.
Функция аминокислот регулирует как клеточный, так и метаболический гомеостаз внутри эмбриона
Итак, вернемся к вопросу, что же делают разные аминокислоты? Выясняется, что намного больше, чем мы думали 2, 3. Существующие данные подтверждают следующие роли (как минимум) аминокислот в процессе развития эмбрионов:
- биосинтетические предшественники,
- источники энергии,
- регуляторы углеводного обмена,
- регуляторы внутриклеточного уровня рН,
- осмолиты,
- антиоксиданты,
- хелаторы,
- и сигнальные молекулы в дифференцировке тканей.
Возможно, некоторые из этих ролей вы и не рассматривали (например, осмолиты и регуляторы pH), но они особенно важны для эмбрионов на стадии дробления, которая, по сути, представляет собой совокупность отдельных клеток без сложных механизмов для регулирования функции клетки. Интересно, что при регулировании гомеостаза одноклеточные организмы обычно используют аминокислоты, такие как глицин. Следовательно, вполне вероятно, что высокий уровень глицина в жидкости фаллопиевых труб выполняет аналогичную роль для ооцитов и на стадии дробления.
Долгая история
Итак, аминокислоты служат для регуляции как клеточного, так и метаболического гомеостаза внутри эмбриона, и без их присутствия в питательных средах эмбрион подвергается значительному стрессу. Излишне говорить, что спустя 25 лет после первых исследований мы собрали много данных о значении аминокислот в раннем развитии эмбрионов, и в результате мы научились при работе с ооцитами и эмбрионами никогда не использовать среды, в которых их нет.
Подождите, история аминокислот еще не закончилась! С появлением метаболоэпигенетики10 и открытием малат-аспаратного челночного механизма регуляции внутриклеточного NAD + 11 (который сам по себе – главный регулятор клеточного эпигенетического состояния) новые исследования позволят выявить механизмы, с помощью которых аспартат и глутамат откроют новые горизонты дальнейшего развития.
Так что, пожалуйста, наслаждайтесь своим протеиновым коктейлем, но обязательно задумайтесь о чудесных аминокислотах в нем!
ССЫЛКИ:
1. Miller JG, Schultz GA. Amino acid content of preimplantation rabbit embryos and fluids of the reproductive tract. Biol Reprod 1987;36:125-9.
2. Gardner DK. Dissection of culture media for embryos: the most important and less important components and characteristics. Reprod Fertil Dev 2008;20:9-18.
3. Gardner DK, Lane M. Embryo culture systems. In: Gardner DK, Simon C, eds. Handbook of in vitro fertilization, 4th Edition. Boca Raton: CRC press, 2017:205-44.
4. Gardner DK, Lane M. Amino acids and ammonium regulate mouse embryo development in culture. Biol Reprod 1993;48:377-85.
5. Lane M, Gardner DK. Increase in postimplantation development of cultured mouse embryos by amino acids and induction of fetal retardation and exencephaly by ammonium ions. J Reprod Fertil 1994;102:305-12.
6. Biggers JD, McGinnis LK, Summers MC. Discrepancies between the effects of glutamine in cultures of preimplantation mouse embryos. Reprod Biomed Online 2004;9:70-3.
7. Wale PL, Gardner DK. Oxygen affects the ability of mouse blastocysts to regulate ammonium. Biol Reprod 2013;89:75.
8. Gardner DK, Kelley RL. Impact of the IVF laboratory environment on human preimplantation embryo phenotype. J Dev Orig Health Dis 2017;8:418-35.
9. Wale PL, Gardner DK. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Hum Reprod Update 2016;22;2-22.
10. Donohoe DR, Bultman SJ. Metaboloepigenetics: interrelationships between energy metabolism and epigenetic control of gene expression. J Cell Physiol 2012;227:3169-77.
11. Gardner DK, Harvey AJ. Blastocyst metabolism. Reprod Fertil Dev 2015;27:638-54.