Шаг к автоматизации интрацитоплазмической инъекции сперматозоидов: подтверждение в реальном времени прохождения пипетки через оолемму и жизнеспособности ооцитов мыши и человека путем измерения электрического сопротивления.
Цель
Оценить, может ли увеличение электрического сопротивления говорить о прохождении пипетки для ИКСИ через оболочку ооцита и его жизнеспособности. Автоматизированная (роботизированная) интрацитоплазматическая инъекция (ИКСИ) требует подтверждения прохождения пипетки через оолемму перед инъекцией сперматозоида. Разработанная ранее визуальная оценка с использованием алгоритмов обработки изображений остается ненадежной. Мы предположили, что увеличение электрического сопротивления при прокалывании оолеммы во время ИКСИ может служить объективным свидетельством прохождения через нее пипетки и жизнеспособности ооцитов.
Дизайн
Экспериментальное исследование.
Научно-исследовательская лаборатория в Академическом центре.
Материалы и методы
В исследовании использовались ооциты женщин и самок мышей.
Пипеткой для ИКСИ проводились проколы оолеммы зрелых (М II) ооцитов мышей возраста 6-12 недель, а также – переданных для исследований незрелых (стадия GV и M I) ооцитов женщин после пункции фолликулов. Электрическое сопротивление измеряли с помощью обычной электрофизиологической установки, включающей в себя измеритель электрического сопротивления и два электрических провода, расположенных в пипетке для удержания клетки и пипетке для ИКСИ.
Основные результаты измерений
Цель состояла в том, чтобы обнаружить изменения электрического сопротивления (ΔR) до и после продвижения пипетки ИКСИ при попытке проникнуть в яйцеклетку. Измерения сопротивления проводились в 3 этапа: 1 (доказательство концепции) – ооциты мыши с проколотой оолеммой против ооцитов мышей с непроколотой оолеммой. 2 – ооциты мыши с визуально интактной оолеммой против фрагментированных ооцитов мыши. 3 – человеческие ооциты с визуально интактной оолеммой против фрагментированных человеческих ооцитов. Для каждой группы медиана и диапазон (в скобках) ΔR определялись в мегаомах. Для сравнения двух групп на каждом этапе был проведен тест Манна-Уитни.
Результаты
На первом этапе яйцеклетки мыши с проколотой оолеммой показали статистически значимое повышение сопротивления по сравнению с ооцитами с непроколотой (n = 20, медиана ΔR = 7,79 [2,57-106,00] против n = 15, медиана ΔR = 0,10 [-0,06 – 0,69] соответственно). На втором этапе ооциты мыши с визуально интактной оолеммой показали статистически значимое повышение сопротивления по сравнению с фрагментированными (n = 45, медиана ΔR = 6,5 [0,1-191,7] против n = 13, медиана ΔR = 0,1 [-0,3-2,2] соответственно). На третьем этапе ооциты человека с визуально интактной оолеммой показали статистически значимое повышение сопротивления по сравнению с фрагментированными (n = 96, медиана ΔR = 1,92 [-0,05-6,70] против n = 17, медиана ΔR = 0,11 [0,00 – 0,30] соответственно).
Выводы
Повышение электрического сопротивления может служить надежным подтверждением прохождения пипетки через оолемму ооцита и его жизнеспособности независимо от оптической визуализации. После дальнейшей валидации и оценки безопасности эта технология потенциально может быть интегрирована в мануальные и роботизированные системы ИКСИ.